穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的糖代謝研究

Ron Orlando

復(fù)雜碳水化合物研究中心，生物化學(xué)和分子生物學(xué)系，化學(xué)系，喬治亞大學(xué)，雅典，GA 30602 USA

“我的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)使用了一系列的CIL產(chǎn)品，他們的產(chǎn)品在蛋白組學(xué)和糖組學(xué)定性定量的表現(xiàn)很滿意。

CIL的銷售人員非常樂于助人并且知識(shí)淵博，他們多次在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上幫助我們，如果沒有他們的幫助我們無法完成這項(xiàng)研究工作?！?/span>--– Ron Orlando

糖基化是真核系統(tǒng)中最常見的蛋白質(zhì)表達(dá)修飾之一。據(jù)估計(jì)60-90%的哺乳動(dòng)物蛋白是糖基化的，事實(shí)上所有膜和分泌蛋白也是糖基化的。糖蛋白在生理代謝中通常起關(guān)鍵作用，例如細(xì)胞識(shí)別，信號(hào)傳導(dǎo)，炎癥和癌變。鑒于蛋白質(zhì)糖基化的重要生理作用，眾多研究團(tuán)隊(duì)致力于特異性聚糖的結(jié)構(gòu)鑒定，表達(dá)蛋白的聚糖，以及對這些結(jié)構(gòu)如何變化的詳細(xì)研究，例如細(xì)胞分化或隨著腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。所有這些努力發(fā)展出了新的研究領(lǐng)域--糖組學(xué)。

質(zhì)譜（MS）已經(jīng)發(fā)展成為一種分析復(fù)雜混合物的方法，以其快速、靈敏、準(zhǔn)確而廣受歡迎。糖組學(xué)研究通常包括質(zhì)譜分析（MS）聚糖的徹底分解產(chǎn)物。雖然對聚糖進(jìn)行定性這是一個(gè)有效方法，但是在MS定量上存在爭議。例如,基質(zhì)效應(yīng)，由于其他化合物的存在對分析電離物的離子抑制現(xiàn)象，能夠在底物濃度不變的情況下影響指定物質(zhì)的分析結(jié)果。其他干擾質(zhì)譜分析結(jié)果的因素包括不同儀器的檢出限，以及儀器存在的誤差，和樣品處理過程中的損失。不同相對定量方法的成功運(yùn)用取決于如何解決原始數(shù)據(jù)存在的誤差。

同位素標(biāo)記技術(shù)的使用可以彌補(bǔ)這些定量的缺陷，因此在各種“組學(xué)”中得到了廣泛的應(yīng)用，其中在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛。穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸在細(xì)胞培養(yǎng)（SILAC）方面就是一個(gè)很好的例子，該方法完美的將同位素標(biāo)記與蛋白質(zhì)結(jié)合，以便用質(zhì)譜來研究蛋白質(zhì)組學(xué)。在SILAC實(shí)驗(yàn)中，兩種細(xì)胞生長在培養(yǎng)基中，其中一個(gè)有“輕氨基酸”（自然豐度），另一個(gè)是重氨基酸（同位素標(biāo)記）（例如，未標(biāo)記和L-賴氨酸·2HCl（13C6，99%）（CIL目錄號(hào)CLM-2247）和L-精氨酸·HCl（13C6，99%）（CIL目錄號(hào)CLM2265））。同位素標(biāo)記的氨基酸代替了細(xì)胞培養(yǎng)中使用的天然氨基酸與所有新和成的蛋白質(zhì)結(jié)合。在細(xì)胞分裂過程中，每一個(gè)特定的氨基酸都被對應(yīng)的同位素標(biāo)記氨基酸替代。這種方法的優(yōu)勢是兩種細(xì)胞裂解后立即混合在一起，因此來自這兩種細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)在相同的樣品處理過程中的消化、純化和分離步驟的實(shí)驗(yàn)條件完全相同。 因?yàn)檫@個(gè)原因，SILAC通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)組學(xué)定量的金標(biāo)準(zhǔn)。

在這篇文章中描述了糖組學(xué)的一種體內(nèi)標(biāo)記的方法，這種方法類似于SILAC在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。這種糖組學(xué)方法叫做IDAWG -（谷氨酰胺對氨基糖的同位素檢測）-這基于谷氨酰胺側(cè)鏈?zhǔn)前被呛塑账岷铣芍形ㄒ坏牡w（圖一）。因此，將L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）引入不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，可產(chǎn)生N15標(biāo)記的包括乙酰氨基葡萄糖、乙酰半乳糖胺和唾液酸在內(nèi)的所有氨基糖類。這導(dǎo)致每個(gè)含N和O的聚糖、糖脂和胞外基質(zhì)多糖的質(zhì)量數(shù)增加+1Da。該方法通過培養(yǎng)在未標(biāo)記和N15標(biāo)記的谷氨酰胺環(huán)境中的小鼠胚胎干細(xì)胞蛋白質(zhì)釋放含N聚糖的實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。這些實(shí)驗(yàn)的成功使我們預(yù)測，未來IDAWG技術(shù)將有助于細(xì)胞培養(yǎng)方面各種比較糖組學(xué)的研究。

圖1：己糖胺生物合成途徑表明谷氨酰胺的側(cè)鏈?zhǔn)翘呛塑账岙a(chǎn)生過程中氨

基糖的唯一氮供體來源，這允許將15N同位素標(biāo)記引入所有氨基糖，包括

GlcNAc、GalNAc和唾液酸。含15N的物質(zhì)用藍(lán)色表示。

結(jié)論

己糖胺生物合成途徑的第一步也是限速步驟（圖1）是糖酵解中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化（果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖胺-6-磷酸）。在這個(gè)步驟中引入的氨基氮僅由Gln（谷氨酰胺）的側(cè)鏈酰胺提供，它被轉(zhuǎn)化為Glu（葡萄糖）。葡萄糖胺-6-磷酸是UDP-GlcNAc的前體，UDP-GlcNAc又導(dǎo)致其他主要的含糖核苷酸氨基糖UDPGalNAc和CMP-唾液酸。因此，所有含有GlcNAc-、GalNAc-和唾液酸的分子都是通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加酰胺-15N-Gln來進(jìn)行同位素標(biāo)記的靶點(diǎn)。

圖2。同位素標(biāo)記的N-連接聚糖。全FT-MS 850-2000m/z二甲基化N-鏈的光譜在未

標(biāo)記的Gln中生長的細(xì)胞釋放的聚糖（2A）或酰胺-15N-Gln（2B）。光譜的擴(kuò)展區(qū)域

顯示15N的預(yù)期2 Da質(zhì)量位移進(jìn)入GlcNAc2Man7的兩個(gè)核心GlcNAc殘基聚糖（2C，

2D）和5-Da增加對應(yīng)于15N摻入羊膜五糖中GlcNAc5Man3Gal2Fuc3聚糖（2E，2F）。

初步實(shí)驗(yàn)，評(píng)估使用代謝標(biāo)記方法將穩(wěn)定同位素植入培養(yǎng)細(xì)胞的聚糖中的可能性。

在這些實(shí)驗(yàn)中，R1小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）是在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的。細(xì)胞培養(yǎng)基通常不含谷氨酰胺，

因?yàn)檫@種氨基酸在水溶液中分解為谷氨酸和氨。這種方式簡化了IDAWG標(biāo)記方法，因?yàn)椴恍枰貏e消耗Gln（谷氨酰胺）培養(yǎng)基。使用15N標(biāo)記的-Gln或未標(biāo)記的Gln以標(biāo)準(zhǔn)濃度（2 mM）補(bǔ)充培養(yǎng)基。這種直接的替代是唯一改變正常細(xì)胞培養(yǎng)程序所需的IDAWG。在這個(gè)例子中，小鼠胚胎干細(xì)胞用標(biāo)記或未標(biāo)記Gln培養(yǎng)三天，然后從蛋白質(zhì)中分離出N-和O-連接的聚糖，用于質(zhì)譜分析。通過比較在未標(biāo)記的Gln或L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）中生長的細(xì)胞釋放的過甲基化N-連接聚糖的FT-MS（超高分辨光譜）光譜，研究了15N并入MESC的N-連接聚糖中的情況（圖2A和2B）。在這些光譜中觀察到的豐富離子對應(yīng)于單電荷或雙電荷的高甘露糖聚糖（GlcNAc2Man5-9）。通過這兩種光譜的對比表明，在重介質(zhì)中生長的細(xì)胞獲得的聚糖離子，雙電荷離子增加了1 m/z單位，單電荷離子增加了2 m/z單位。這個(gè)預(yù)期的結(jié)果，前提是15N已并入這些聚糖中所含的兩個(gè)核心GlcNAC，并且這是高甘露糖聚糖中唯一的氮。

在仔細(xì)觀察雙電荷分子離子（M+2Na）2+時(shí)，可以清楚地看到聚糖質(zhì)量的這種變化，這種雙電荷分子離子是由GlcNAc2Man7聚糖產(chǎn)生的，它分別以1005.5和1006.5 M/z單位出現(xiàn)在14N和酰胺-15N的聚糖中（圖2C和2D）。在這些光譜中，響應(yīng)最強(qiáng)的離子出現(xiàn)在用14N或兩個(gè)15N計(jì)算的單同位素質(zhì)量處，這表明這種聚糖的大多數(shù)都有15N結(jié)合到兩個(gè)可能的位點(diǎn)。存在與標(biāo)記不足相對應(yīng)的離子，即零和一個(gè)15N的結(jié)合；然而響應(yīng)最強(qiáng)的是完全標(biāo)記的。

大量的N-連接聚糖通過每個(gè)GlcNAc端基插入一個(gè)15N而質(zhì)量相似地增加。這可以通過擴(kuò)展圖2A和2B中所示的光譜來觀察，以便僅觀察到從960.5到964.1的區(qū)域（圖2E和2F，分別針對在14N和酰胺15N Gln培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞釋放的聚糖。該區(qū)域顯示了分子離子，（M+3Na）3+，用于組成GlcNAc5Man3Gal2Fuc3的復(fù)雜聚糖。正如所預(yù)測的，當(dāng)從生長在15N-Gln中的細(xì)胞中獲得該聚糖時(shí)，其單同位素離子增加了+5Da。此外，完全標(biāo)記的聚糖是主要存在形式，然而不完全標(biāo)記的，卻能從標(biāo)記不完全處觀察到離子。

通過計(jì)算15N光譜強(qiáng)度的不同同位素，表明該聚糖中含有98%的15N，恰好等于這個(gè)實(shí)驗(yàn)所用谷氨酰胺中15N的量。對其他聚糖的同位素分布的類似計(jì)算表明，它們的15N摻入范圍為96-98%。這些實(shí)例表明，L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）中的15N被廣泛地并入N-連接聚糖的GlcNAc端基，表明這可能是將穩(wěn)定同位素引入聚糖的有效方法。

討論

聚糖的代謝標(biāo)記為評(píng)估在培養(yǎng)中誘導(dǎo)或維持的任何細(xì)胞行為過程中聚糖轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)提供了許多新的機(jī)會(huì)。例如，用L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）標(biāo)記細(xì)胞，然后用輕Gln代替培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，可以測定任何含氨基糖聚糖的半衰期。以前，聚糖轉(zhuǎn)化研究需要結(jié)合放射性單糖和廣泛的后續(xù)分餾，以確定聚糖表達(dá)的具體變化。一般來說，這些放射性示蹤技術(shù)能夠非常靈敏的檢測聚糖類物質(zhì)，但在跟蹤個(gè)別聚糖結(jié)構(gòu)或亞群的生物合成相關(guān)物質(zhì)上分辨率低。本文報(bào)道的穩(wěn)定同位素?fù)饺敕▽⒏叻直媛寿|(zhì)譜的分析優(yōu)勢與理解聚糖轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)的生物學(xué)必要性結(jié)合起來。因此，IDAWG呈現(xiàn)出一種有效的定量方法，探索聚糖、糖蛋白和糖脂在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的生物學(xué)作用。

感謝

本研究由美國國立衛(wèi)生研究院/NCRR資助的生物醫(yī)學(xué)糖組學(xué)綜合技術(shù)資源（P41 RR018502）和美國國立衛(wèi)生研究院/NCRR資助的綜合糖技術(shù)研究資源（P41 RR005351）資助。

SILAC相關(guān)產(chǎn)品

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